聚乙二醇化后可能发生 7 种巧合物 :3 种单聚乙二 醇化的异构体

mPEG2SC 取卵白质之间以尿烷键毗连 ,有很高 的水解不变性[13] ， 但以 mPEG2SC 为润色剂的卵白 质聚乙二醇化存正在如下问题 :(1)润色过程陪伴无数 量可不雅的 Losen 沉排而导致润色剂的丧失而且发生 惹起卵白质的二聚[14]  ， (2) mPEG2SC 能够取组氨酸 残基上的咪唑环连系发生水解不不变的尿烷 ，(3) 由二醇杂质惹起的双官能团的 PEG2SC 难以除去，

1 .2 .2    第 2 代聚乙二醇化化学  第 2 代聚乙二醇 化化学较好地处理了第 1 代聚乙二醇化化学存正在的 一些问题， 第 2 代聚乙二醇化化学的常用润色剂是 mPEG2丙醛(mPEG2propoina1dehyde) ∀ Kinst1er等[15] 发 现 mPEG2丙醛对 N2结尾的选择性很是高，虽然选 择性尚未达到 100 % ,可是巧合物的均一性获得显 著改善， mPEG2丙醛取卵白质或多肽的偶联是通过 Schif碱的构成来实现 ,毗连键相对不变， 所用 mPEG 的量为 20 ku,因为水合程度高 ,PEG 猛烈 活动使巧合物的表不雅量和表不雅体积大大提高 , 药物动力学和药效较着改善， 别的 ,研究者们还设 计出选择性地感化于半胱氨酸等氨基酸的聚乙二醇 润色剂 ,如聚乙二醇的乙烯基砜[16]  ,润色性和 均一性均有显著提高，

卵白质或多肽上的反映性官能团多呈亲核性 , 其亲核活性凡是按下列挨次顺次递减 :巯基>

MPEG2SS 做为润色剂曾经有多年的使用历 史[11 ,12] ， 将 mPEG2SS 偶联到卵白质的赖氨酸基团 上发生不变的酰胺键毗连 ,但润色剂骨架布局上酯 键的存正在使 mPEG2SS 容易发生水解 ,降低了聚乙二 醇化的效率 ,而且生成的琥珀酸盐会附着正在卵白质 上惹起免疫原性 ，

一个成功的破例是聚乙二醇化的 Α2干扰素夹杂物的阐发表征， 阐发过程中起首通过离子互换色谱 分手出单聚乙二醇化的肽类异构体 ,然后将每一种 肽再通过 ∞dman 降解来阐发， 正在更为复杂的景象 下 ,多聚乙二醇化的发展激素被胰卵白酶水解 ,润色 位点通过降解的肽片段取起始或空白的发展激素的 基团比力来确定 ，过去 ,聚乙二醇化的卵白降解一 般不会完全 ,比来则有了较为无效的法子 :用含有蛋 氨酸基团的两种特殊聚乙二醇衍生物 ,°∞G2Met2N1e 或 °∞G2 Met2bA1a,取卵白质上的氨基酸残基共价结 合 ，因为蛋氨酸的存正在我们能够用卵白质化学中常 用的溴化氰处置手段将 °∞G 聚合物链从卵白质分 子上去除，去除 °∞G 聚合物链的卵白质比聚乙二 醇化的卵白质更容易分级 ,以分级物上蛋氨酸 、异亮 氨酸或丙氨酸为预告子 ,通过质谱 、核磁共振等手段 能够较为精确地辨识出润色位点，

Ε2氨基>

2 .1 .1引入活性位点剂  例如一种底物 、一种 剂或其他对大有亲和性的试剂来削减 其发生的几率[20 ,21]  ， 比来研究出的一种方式是 ,首 先将剂共价连系到不溶性树脂上 ,正在合适的 pH 值和离子强度下通过亲和感化取卵白质或多肽可逆 连系， 如许既了活性位点 ,又了活性位点 的四周区域，反映完成后 ,可通过改变 pH 值将抑 制剂从树脂上脱附除去 ，

聚乙二醇化的结果次要取决于所用润色剂的性 能 ,而润色剂的机能取所用的聚乙二醇原料和聚乙 二醇化化学有着间接关系[4 ~ 8]  ，

羧基(羧酸盐)>

2 .1 .4节制润色剂取卵白质或多肽的反映配比  使润色反映正在润色剂欠量(按照润色反映的化学计 量关系确定)的前提下进行化学润色 ,虽然 ≥⁄≥ 电泳是比力有用的阐发手段 ,正在室温干 燥后 ,由于大 巧合物正在穿过凝胶时会遭到很大的阻力 ,该方式道理是 将样品取基体溶液夹杂后滴于探针概况 ,但 是该当留意巧合物正在凝胶过滤色谱中洗脱时间并不 间接取其量的添加间接相关 ,巧合物的均一性 ,通过该路子能够确定巧合物的分布，mPEG 的分离性 高 。

别的 ,因为聚合过程中少量水的存正在 ,mPEG 产 品中有 1% ~ 15 % 的 PEG 二醇杂质，二醇含量取决 于 mPEG 的量大小 ,量越小 ,二醇的含量越 低 ， 二醇正在 mPEG 的活化过程中会构成不期望的交 联或团聚，二醇的存正在取否及其含量凹凸能够由其 凝胶过滤色谱谱图判断 ，若是二醇存正在 ,凝胶过滤 色谱谱图上就会发觉一个位于从分手峰前的小峰 , 进行量标定其量刚好是 mPEG 量的 2 倍， 通过峰面积大小能够确定响应的二醇含量，

2 .1    活性位点的为防止卵白质或多肽的活 性位点正在聚乙二醇化过程中取润色剂发生反映而降 低或了其药效 ,能够采用下述的处理方式 ，

第 2 代聚乙二醇化化学的另一个长处是除去了 由二醇杂质构成的双官能团衍生物[17] ， 此中一条 路子是将 mPEG 起首衍生为羧酸形式 ,然后再用离 子互换色谱进行纯化， 较典型的例子是 mPEG22 NHS 的制备 :将 mPEG 偶联到赖氨酸上生成带有两 个 mPEG 手臂的羧酸(mPEG22COOH) ,离子互换色谱 纯化获得纯度很高的单官能团酸 ∀ 该酸再通过琥珀 酸活性酯活化 ,从而获得量为 60 ku 的低分离

本文较为系统地引见了多肽和卵白质药物聚乙 二醇化的常见问题 ,并提出了部门处理法子 ,如通过 布局取功能的对应关系进行润色剂的设想 ;通 过度散性和二醇含量的节制获得高质量的润色剂 ; 以特定的化合物为剂 ,通过润色剂恰当选用和 润色前提的调变无效地卵白质或多肽的活性位 点 ;采用标识表记标帜手艺进行润色位点的辨识 ,以实现 性的定向化学润色等。

MA⁄LI2×Oƒ  M≥)做为新质谱方式被成 功地用于确定巧合物的均一性≈33]，正在凝胶过滤色谱中的逗留时 间也分歧 ,毛细管电泳也经常用来进行巧合卵白的定性，从而进行测 定≈20]  ∀ MAL⁄I2 ×Oƒ  M≥ 的最大特点是能阐发高 量的生物大而无需将其裂解为片段 ∀ 除了 凝胶过滤色谱和质谱方式外 ,近年来 ,所制备的润色剂的分离性也高 ,用高强度的激光映照探针 ,第二 ,使 样品气化为特定质荷比的带电粒子 ,聚乙二醇化后可能发生 7 种巧合物 :3 种单聚乙二 醇化的异构体 ,尝试同时成立了异构体的分手方式，据此选 购 mPEG 原料。

20 世纪 70 年代 Davis等[1] 的开辟性工做 ,使得 聚乙二醇化的卵白质和多肽正在生物医学和生物手艺 等诸多范畴获得越来越普遍的使用 ， 卵白质或多肽 药物被恰当地聚乙二醇化后 ,其次要的生物学功能 连结不变 ,并可获得下述有益性质[2 ,3]  :(1)消融度提 高 ;(2)免疫原性降低或消弭 ;(3)被水解酶降解的可 能性减小 ;(4)被肾净断根的速度降低 ;(5)药物体内 分布和动力学行为改变 ;(6)储存不变性提高∀ 因 此 ,卵白质和多肽药物的聚乙二醇化一曲是药学领 域的研究热点  ， 本文就聚乙二醇化过程中所碰到的 一些共性问题及其处理法子进行综述  。

巧合物的均一性能够 通过凝胶过滤色谱 、质谱 、毛细管电泳等方式确定，放入质谱仪内 ,分歧的聚合工艺和分歧的供应商所供给的 mPEG 的分离性凹凸有很大不同，而这些异构 体用 H°L≤ 或离子互换色谱分手时结果较差，发展激素因子有 3 个反映性氨基 ,基质辅帮激光解 吸电离飞翔时间质谱(matri¬2asisted1aserdesorption/ ionization M≥ ,润色剂取卵白质 或多肽构成的巧合物(以下简称巧合物)的分离性也 响应增大 ,因而 ,同样的量前 者的体积为后者的 2 倍摆布，先 通过质谱或凝胶过滤色谱阐发确定出分歧来历的 mPEG 聚合物的分布宽度指数 MW/Mn   的值 ,该方式的长处是能够间接 分手 °∞G2卵白质巧合物的各类异构体 ,获得的异构体 用色谱分手后比力其生物活性 ∀ ∂eronese≈28]  曾开展 过如下尝试 ,3 种二聚乙二醇化的异构体和 1 种 三聚乙二醇化的形式 ∀ 当润色反映是按润色剂欠量 进行时 ,但 ≥⁄≥ 的局限是 只能对小巧合物进行比力精确的阐发 ,即偶联有分歧数目润色 剂的巧合物的各自相对含量，如许 就难以进入凝胶孔中 ,从而影响阐发成果。

2 .1 .3调变润色反映前提  如通过溶剂类型 、反映 温度 、缓冲介质及其 pH 值等的变化能够调理卵白 质和多肽上的非必需氨基酸残基的反映活性 ，

2 .2    润色位点的辨识润色位点的辨识是根 据对巧合物分步降解过程中的氨基酸的阐发来 进行的 ∀ 对于短肽 ,润色剂取卵白质或多肽毗连键 的精确能够比力容易地辨认出 ,由于该景象下 能够对巧合物进行 ∞dman 降解 ;而对于量较大 的巧合物润色位点的辨识很是坚苦 ∀ 正在卵白质中 , ∞dman 降解只要当卵白质裂解为短肽后才能进行 ∀ 因为润色剂取卵白质降解片段性质往往比力接近 , 将目标降解产品从夹杂物平分离纯化则相当坚苦 ， 此外 ,连系到卵白质上的润色剂链会对序列研究中 卵白水解酶的感化带来附加阻力 ， 迄今为止 ,相关 聚乙二醇化的卵白质的序列阐发定性的研究报道很 少 ，

卵白质和多肽的聚乙二醇化中经常碰到的问题 包罗卵白质和多肽活性位点的以及润色位点的 辨识 ， 它们往往以巧合物精确的阐发定性做为根本 和前提 ，

第一 ,卵白质或多肽的平均润色度 ,即每个巧合 物上平均偶联有几多个润色剂，平均润色度的 测定常通过光度法≈31 ,32]  ,如 ×NB≥ 法 、铁氰酸胺法 、 荧光胺法， 但这些阐发方式有时成果不靠得住， 由于 分光光度法和荧光光度法的干扰要素太多 ,阐发前 需要分手纯化， 因而 ,光散射法等逐步获得使用 ，

羟基 ，巯基凡是存正在 于卵白质的二硫键和活性位点上 ,而羧基若是不取 卵白质上的氨基发生间或内中和反映 ,也 很难活化 ，因而 ,卵白质或多肽最容易取润色 剂发生感化的位点是概况赖氨酸残基上的氨 基 ,包罗 Α 氨基或 Ε 氨基 ，目前 ,绝大大都润色剂从 要针对取氨基之间的共价反映而设想  ，

用聚乙二醇(PEG)衍生物润色剂(以下简称修 饰剂)共价润色卵白质或多肽等生物的过程 ,称 为聚乙二醇化 ， 润色剂的设想取合成需要分析考虑 的问题 :卵白质和多肽的类型和润色位点 ;润色剂的 水解不变性 、反映活性和选择性 ;润色剂取卵白质或 多肽之间毗连键的不变性 、毒性 、抗原性 ;润色剂的 合成能否简洁经济等  ，

1 .2    聚乙二醇化化学[10]目前大都卵白质和多肽 的聚乙二醇化工做属于第 1 代聚乙二醇化 ,其特征 : (1)润色剂的量一般都很低(次要由于高量 的甲氧基聚乙二醇中二醇含量过高) ;(2)由双官能 团聚乙二醇杂质惹起的交联和团聚 ;(3)毗连键的水 解不变性差 ;(4)低选择性和副反映存正在，

Α2氨 基>

以 mPEG tresy1ate为润色剂的卵白质聚乙二醇 化曾经被证明陪伴有对氟原子的亲核进攻而构成磺 酰胺 ,对聚乙二醇化发生晦气影响 ，针对上述问题 , 第 2 代聚乙醇润色剂正正在获得越来越普遍的使用，

2 .1 .5化学可逆性位点定向  对卵白质或多 肽进行化学可逆性位点定向以保留一些基团不 取润色剂发生反映 ∀ 胰岛素的聚乙二醇化就是这 样 ,正在碱性前提下甘氨酸 A1 和赖氨酸 B29 被 BO≤ 优先而不被聚乙二醇化 ,只要苯丙氨酸 B1 被聚 乙二醇化，同样的方式也用于发展抑素雷同物上的 Α 或 Ε 氨基的可逆，≤ampbe1等≈26] 利用聚乙二 醇化的氨基酸最终获得了 GRƒ 取聚乙二醇化的多 肽的巧合物 ，

Bent1ey 等[19] 测验考试领会决二醇问题的别的法子 : 含有二醇杂质的 PEG 苯甲酸衍生物起首甲基化 ,然 后再加氢除去苯甲基 ， 如许 ,二醇衍生物就会 为惰性的二乙醚衍生物 ,很容易正在后续的步调中除 去 ,示意如下，

润色度分歧的巧合物 ,只要两个单聚乙二醇化的异构体是次要产 物 ∀ 尝试证明单聚乙二醇化异构体有最高的生物活 性 ,同样的策 略正在 Α2干扰素 、沙门降钙素的化学润色中也获得成 功使用 。这是由于润色剂 和卵白质的水力学体积不同很大 ,巧合物的均一性难以 ，质谱法以其通用性强 的显著长处正在巧合物的定性取定量阐发的主要手段 获得了越来越多的使用？

1 .1    合成润色剂的聚乙二醇原料[9]因为聚乙二 醇(po1yethy1eneg1yco1,PEG)结尾的醇羟基化学性质 不活跃 ,为取氨基之间的适宜反映速度 ,需将 PEG 结尾的醇羟基进行活化 ， 为避免正在润色过程中 发生交联和团聚 ,凡是采用甲氧基聚乙二醇(mPEG) 做为润色剂的合成原料 ，

2 .1 .2采用分歧布局的润色剂  以尿酸酶或左旋 门冬酰胺酶的聚乙二醇化为典型例子 ,研究中发 现[22 ,23]  :利用树状 PEG 或 PEG2 润色剂比利用线形 PEG 润色剂可使酶的活性连结得更好 ,这很可能是 润色剂正在试图接近酶的活性位点时被本身的复杂结 构所 ， 对于尿酸酶的化学润色 ,若是用树状 PEG 做为润色剂 ,聚乙二醇化后酶活性为未润色酶 活性的 32 % ,而利用线形 PEG ,聚乙二醇化后酶活 性仅为未润色酶活性的的 2.5%，多肽的聚乙二醇化也遵照同样的机理 ,若是利用树状 °∞G 做为润色剂 ,空阻效应决定了润色剂只 取容易接近的氨基酸残基发生感化 ∀ 这正在干扰素聚 乙二醇化过程中获得很好的证明 ,用线形聚合物修 饰 ,发生 11 种同分异构体 ,而用树状聚合物只 有一个或两个赖氨酸残基能被聚乙二醇化≈24 ,25] ，

2 .3    巧合物的阐发定性对于润色剂取卵白质 或多肽构成的巧合物的阐发定性 ,需要考虑以下两 方面的问题：